Baiba Cabovska,¹Douglas M. Stevens,¹A. John Cunningham²  和Arthur E. Bailey²

¹沃特世公司(美國馬薩諸塞州米爾福德市)

²曼恩凱德生物醫療公司(美國康涅狄格州丹伯里市)

應用優勢

有利于為諸如制藥、化工原料和食品工業等需要進行結構解析工作的領域解決未知化合物鑒定所面臨的難題。提供一套鑒定可提取物的系統化工作流程。與QTof聯用的GC或UPLC均可采用同一工作流程。

沃特世解決方案

Xevo^® G2 QTof質譜儀

大氣壓氣相色譜電離源(APGC)

MassLynx^®軟件

MS^E技術

MassFragment™軟件

關鍵詞

可提取物，浸出物，樹脂，單體和低聚物，增塑劑，穩定劑，填充劑，著色劑，抗氧化劑，抗靜電劑，元素組成

簡介

根據美國FDA要求，制藥行業需確保在預期產品保質期內藥品的包裝材料中不會有任何有毒或有害物質遷移到藥品中^1-5。同樣，在食品和化妝品行業，人們對產品中存在的包裝材料浸出物的研究也非常關注。根據定義可知，可提取物是指在可控的提取條件下從包裝材料或設備組分中提取出的化合物。浸出物則是在正常保質期內從包裝材料遷移至產品中的化合物。在理想情況下，浸出物也可視作一種可提取物。如果一個公司無法對所有潛在污染物進行全面準確的鑒定，或是至少清楚了解化合物類別，那么很可能會導致產品召回、經濟損失和/或品牌形象受損等嚴重后果⁶。

因此，我們開展了一項名為受控提取研究的初步調查，其中涉及某些類型的溶劑提取，如回流法、微波法或超臨界流體萃取法⁷。所選溶劑必須涵蓋較大的極性范圍，以確保非極性和極性分析物均能被提取。用于分析提取物的技術必須具有綜合性，可以適用于盡可能多的分析物，包括GC-FID-MS(揮發性物質)和LC-UV-MS(非揮發性物質)⁵。

在受控提取研究中，我們發現對于化合物來說真正的挑戰就是對它的鑒定。很少有樹脂生產商能夠提供包裝材料聚合物中所使用的全部添加劑的完整清單。并且，原材料在生產過程中可能會降解或發生化學變化。此外，樹脂生產商可能并不了解化合物中可能存在的污染物。典型的可提取物包括由不完全聚合反應生成的單體和低聚物；增塑劑、穩定劑、填充劑、著色劑、抗氧化劑和抗靜電劑，以及它們的降解產物。除此之外，還有在模塑工藝后樹脂中殘留的洗滌劑和脫模劑.

實驗
樣品制備

采用微波提取法制備樣品。將聚丙烯和尼龍樣品(2 g)用10 mL異丙醇在70 °C下提取3 h。提取完成后，將上清液轉移到GC樣品瓶中。

MS條件

MS系統：          Xevo G2 QTof與7890A GC

色譜柱：            HP1-MS，30 m x 0.32 mm，1.0微米膜

載氣：              He，2 mL/min

升溫程序：         35 °C下保持5 min，以20 °C/min升至320 °C，保持20.75 min

進樣口：            300 °C

進樣類型：         1 微升，不分流，1 min吹掃

輔助氣體：         N2，500 mL/min

掃描范圍：         50至1000 Da 

MS^E碰撞電壓：    15至25 eV

數據管理：         MassLynx 4.1版軟件

利用單四極桿GC/MS所獲得的一些分析物數據可通過市售譜庫(例如NIST)進行確認。但是，當譜庫中未收錄目標化合物或單四極桿MS靈敏度不足以進行分析物陽性鑒別時，揮發性物質分析所面臨的難題就出現了。這時可以結合另一種技術，例如本應用資料所介紹的大氣壓氣相色譜(APGC)和四極桿飛行時間(QTof)質譜⁸。由于譜庫中沒有LC/MS數據，因此精確質量數數據將十分有利于非揮發性物質的分析。對于本文中所進行的揮發性物質和半揮發性物質分析來說，使用市售結構解析工具在四極桿飛行時間質譜儀中采集的MS^E數據已被證明在未知化合物的鑒定中具有重要意義。

工作流程

結果與討論

本研究采用了兩種廣泛使用的聚合物材料：聚丙烯和尼龍。在本應用紀要中，對三類不同的可提取物進行了鑒定：抗氧化劑、單體和單體降解產物。
 

如圖1所示，在聚丙烯樣品中，觀察到一個色譜峰(峰A)出現在保留時間26.3 min處。在精確質量數APGC譜圖中進行元素組成分析，如圖2所示，結果表明其分子式為C₄₃H₆₃O₃P，如圖3所示。元素組成軟件通過觀察到的質量數計算可能的分子式，并使用同位素模型算法，將每個候選分子式所觀察到的模型與理論模型進行匹配。在這種情況下，對于該離子有兩種選擇，如果僅考慮質量數差異，則第二個更為接近。而結合質量數差異和同位素匹配可得到一個最佳的正確結果。

在干燥模式的源條件下進行APGC分析⁹，可以優先于質子化加合物([M+H]+)促進分子離子(M.+)的形成。值得注意的是，在高能碰撞條件下，相比質子化加合物，分子離子碎片更易產生；因此，在兩種通道中基峰存在顯著差異(646.4與647.4)，如圖2所示。

在ChemSpider中搜索建議的元素組成分子式，結果為Irgafos 168，如圖4所示，根據Little等人所述，按“# of References”(參考編號)排序，該結果為最佳答案¹⁰。Irgafos 168是一種亞磷酸三芳基酯加工穩定劑，可保護樹脂聚合物(如聚丙烯)，防止其在樹脂合成過程中發生氧化。

數個碎片與主要碎片離子Irgafos 168相匹配，從而增加了鑒定的可靠性，如圖5所示。MassFragment可識別母離子結構中的化學鍵，并根據化學鍵斷裂的類型和可能性分配一個分值。另外，還會列出化學鍵斷裂的數目。分值越低(如，S:1.0，B:1.0與S:4.5，B:2.0)，產生該碎片結構的可能性越大。

此工作流程的下一個步驟是購買標準品，并與樣品的保留時間和碎片離子圖進行比較。

眾所周知，月桂精內酰胺是一種生產尼龍的原材料。在尼龍提取物中，檢測發現月桂精內酰胺單體(峰B)的保留時間為15.93 min，如圖6所示。按照先前示例所述的工作流程通過分子式和MassFragment報告確認該峰。在保留時間16.07 min處觀察到一個較小的峰(峰C)。測得的質量數與分子式C12H21NO相符，如圖7所示，這表明該峰可能是分子內具有額外雙鍵的月桂精內酰胺降解產物(月桂精內酰胺單體為C₁₂H₂₃NO)。通過存在的內源二聚體(2M+H)確認各個譜圖中的母離子。對于月桂精內酰胺，所觀察到的二聚體為m/z 395.3652，其降解產物的二聚體為m/z 391.3324。

使用ChemSpider搜索C₁₂H₂₃NO，結果顯示月桂精內酰胺為第二最佳選擇。而搜索C₁₂H₂₁NO時，根據聚合物中的已知化合物未得到合適的匹配結果。

由于可能無法取得該降解產物的標準品，因此可以通過Xevo G2 QTof數據為此化合物指定一個結構。我們無法確定月桂精內酰胺環中雙鍵的確切位置。然而，在這類研究中，并不一定必須確定化合物的確切結構，只需確定化合物的類別即可。顯而易見的是，該降解產物與月桂精內酰胺相關，因此可以預計其毒理學特性與月桂精內酰胺相似。

結論

♦Xevo G2 QTof是一種用于可提取物的鑒定和結構解析的重要工具。利用MS^E功能，可以同時采集母離子和碎片離子信息。精確質量數和碎片信息有助于確定許多未知化合物的結構。

♦當市售譜庫中未提供目標化合物的信息時，元素組成和Mass Fragment軟件可以提供與分析物相關的額外信息。

♦本文所述的工作流程有利于為諸如制藥、化工原料和食品工業等需要進行結構解析工作的領域解決未知化合物鑒定所面臨的難題。

♦通常，根據已知存在的組分并結合碎片、最可能的分子式和一些化學常識，便能夠獲得可能的化合物結構。在可提取物的研究中，如果目標是建立安全性閾值，那么一個可能的化學結構通常就能提供充分的依據。

參考文獻

1.  M P Balogh. “Testing the Critical Interface: Leachables and Extractables”. 

LCGC, June 1, 2011.

2.  F Mofatt. Extractables and Leachables in Pharma-Serious Issue.   

http://www.solvias.com/sites/default/files/solvias_whitepaper_web.pdf

3.  Containers Closure Systems for Packaging Human Drugs and Biologics; 

Guidance for Industry. U.S. Department of Health and Human Services Food 

and Drug Administration Center for Drug Evaluation and Research (CDER) and 

Center for Biologics Evaluation and Research (CBER), Rockville, MD. May 1999.

4.  D L Norwood, Q Fenge. Strategies for the analysis of pharmaceutical excipients 

and their trace level impurities. Am Pharm Rev. 7(5): 92, 94, 96-99, 2004.

5.  Safety Thresholds and Best Practices for Extractables and Leachables in Orally 

Inhaled and Nasal Drug Products, Leachables and Extractables Working Group. 

Product Quality Research Institute (PQRI), 2006. (WWW.PQRI.ORG).

6.  http://www.webmd.com/pain-management/news/20110629/

new-tylenol-recall-due-to-musty-odor

7.  M Ariasa, I Penichet, F Ysambertt, R Bauza, M Zougaghc, Á Ríos. Fast 

supercritical fluid extraction of low- and high-density polyethylene additives: 

Comparison with conventional reflux and automatic Soxhlet extraction.  

J. of Supercritical Fluids, 50: 22-28, 2009.

8.  Detection and Identification of Extractable Compounds from Polymers.  

Waters Technology Brief, no. 720004211en, January, 2012. 

9.  Determination of High Molecular Weight Phthalates in Sediments Using 

Atmospheric Pressure Chemical Ionization GC/MS. Waters poster,  

no. PSTR134667160.

10. J L Little, A J Williams, A Pshenichnov, V Tkachenko. Identification of “known 

unknowns” utilizing accurate mass data and ChemSpider. JASMS. 23(1): 

179-185, 2012.