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關(guān)于高效液相首選等度洗脫，流動相比例越簡單越好，能不用緩沖鹽就不用，洗脫方法越簡單越好、色譜柱越常見越好，但是有的時(shí)候用單一比例的流動相或者是常見色譜柱是無法滿足很多雜質(zhì)的分離，這時(shí)就需重新開發(fā)色譜分離方式。下面為一些分析條件開發(fā)的個(gè)人的經(jīng)驗(yàn)，希望給新入行的朋友一些實(shí)驗(yàn)靈感。
01
確定目標(biāo)化合物性質(zhì)
首先需要明白待分離雜質(zhì)的一些性質(zhì)，比如說分子量、結(jié)構(gòu)式（主要看有哪種基團(tuán)），以及該種物質(zhì)在哪種有機(jī)溶劑中易容。結(jié)構(gòu)式對于分子極性大小的預(yù)測以及判定該物質(zhì)是否容易水解有非常重要的作用。例如我們常見的-、-NHR、-、-COOH、-0H等都是比較常見的極性基團(tuán)；而常見的苯環(huán)、-CH=、--等都是常見的非極性基團(tuán)。根據(jù)經(jīng)驗(yàn)可以大致的判斷一下物質(zhì)的極性，預(yù)估一下在常用的色譜柱上是否保留，再結(jié)合雜質(zhì)在各種常見洗脫溶劑中的溶解性，例如在甲醇、乙腈、正己烷中哪個(gè)比較易溶，選擇適合用于洗脫的有機(jī)流動相，從而確定方法開發(fā)時(shí)是用正相色譜柱或者是反向色譜柱做出粗略判斷。
02
確定正反相洗脫方式
確定洗脫方式后，反向的話個(gè)人推薦先用60%的乙腈或者是甲醇，先去看一下你需要分離的幾種物質(zhì)能否被分開，（正相洗脫方式思路相近）。在能分開的前提下，再看一下最后一個(gè)峰的出峰時(shí)間，如果時(shí)間比較長的話，再根據(jù)前幾個(gè)峰的分離度確定是否需要加大或者縮小有機(jī)相的比例。我們常見的洗脫分離方式為反相分離，而反相洗脫方式又分為兩種體系，一種是甲醇-水體系，另外一種是乙腈-水體系。
具體是選擇哪種反相洗脫體系需要根據(jù)以下條件來決定：
A、乙腈的洗脫能力要優(yōu)于甲醇，在同等濃度、樣品下乙腈-水體系的目標(biāo)峰出峰要快于甲醇-水體系。
B、甲醇溶于水是會放出熱量的，乙腈溶于水是會吸熱的，在同等方式的梯度洗脫方式下，在兩種流動相互相混合時(shí)由于分子熱運(yùn)動的原因，甲醇溶于水比乙腈溶于水時(shí)的分子熱運(yùn)動劇烈，這樣兩種流動相的混合會更加均勻，反映在基線上的表現(xiàn)為基線更加的平滑，且梯度峰要更少。
C、甲醇在市面上的售價(jià)要低于乙腈（如果財(cái)大氣粗的公司可以忽略這一條）。
D、甲醇的分子量大于乙腈，在同一色譜柱、相同濃度的有機(jī)相濃度下，乙腈-水體系的柱壓更小。
E、甲醇的截止吸收波長在210nm附近，而乙腈的截止吸收波長在190nm附近，在檢測波長遠(yuǎn)離210nm的時(shí)候選擇甲醇或是乙腈-水體系主要看其它影響因素。但是測定波長在210nm附近時(shí)，由于甲醇的截止吸收波長大于乙腈，除了流動相不同外，相同的測定條件下，乙腈-水體系測定的樣品響應(yīng)值更高，從而能夠得到更小樣品檢出限，此時(shí)建議優(yōu)選乙腈-水體系。
03
確定色譜柱、流速、柱溫
實(shí)驗(yàn)室分析中最常用的就是類型的色譜柱，一般為5μm0.46×250mm或者是0.46×150mm，在試驗(yàn)前期如果在沒有參考資料的情況下，首選最為普通的 5μm0.46×250mm的色譜柱試一下；如果發(fā)現(xiàn)用5μm0.46×250mm的色譜柱去分離多種雜質(zhì)時(shí)，有分叉峰出現(xiàn)或是理論塔板數(shù)比較低時(shí)則提示我們這種類型的色譜柱對該物質(zhì)的分離是不太好的，需要我們更換柱效更高的色譜柱，通常選擇粒徑、填料更小的色譜柱，這個(gè)需要根據(jù)實(shí)際情況，進(jìn)行試驗(yàn)后確定適用于檢測的色譜柱。
而流速的選擇通常是要根據(jù)色譜柱的具體類型，最高的耐受壓力來決定，常用的色譜柱一般流速為1.0mL/min，其實(shí)流量對雜質(zhì)分離的影響比較小。
柱溫首選室溫，柱溫的升高會影響雜質(zhì)的出峰快慢，理論上柱溫越高，各種物質(zhì)的出峰會越快，同時(shí)色譜柱的柱壓也會越小，但是由于溫度比較高會導(dǎo)致色譜柱中填料的健合相容易被流動相沖刷下來，導(dǎo)致色譜柱不可逆的柱效下降。因此色譜柱溫度不宜過高，一般溫度設(shè)定為25~35℃，當(dāng)然也有特殊的品種有的需要柱溫在40℃甚至更高。
04
梯度洗脫程序的篩選
在選擇好用正反相洗脫方式、確定用的色譜柱、柱溫、流速后，無論如何調(diào)整梯度及流動相比例都無法將兩種雜質(zhì)分離開后，那么就需要用到梯度洗脫方式。梯度洗脫是一種在不同的時(shí)間加入不同有機(jī)比例流動相的一種洗脫方式。與傳統(tǒng)的等度相洗脫方式比具有以下優(yōu)點(diǎn)：
A、能夠增加兩種物質(zhì)的分離度，通過不同時(shí)間段加入有機(jī)相濃度的不同，使雜質(zhì)在不同時(shí)間段受到有機(jī)相洗脫的濃度不同，一般原則是逐步增加有機(jī)相的比例，從而使難被洗脫出來的雜質(zhì)加快出峰。
B、由于可以調(diào)整有機(jī)相加入的濃度，與等度洗脫相比，可以縮短分析時(shí)間，還可以一次性將等度洗脫分不開的幾種物質(zhì)分開，從而用一種分析方法分析多種物質(zhì)，降低成本。
梯度洗脫程序的摸索過程，需要遵循以下原則：
原則一：不使用單一流動相
初級實(shí)驗(yàn)者梯度洗脫的時(shí)候，流動相A一般為緩沖鹽，流動相B一般為純的有機(jī)相。但是高級實(shí)驗(yàn)者使用的A相往往不單純使用緩沖鹽，而是要加入一定比例的有機(jī)相，原因有兩個(gè)。
第一是加入最少5%的甲醇或者乙腈可以防止流動相長菌，減少頻繁的過濾流動相這一操作。
第二是加入一定比例的有機(jī)相可以減小在儀器進(jìn)行流動相A、B相互混合時(shí)造成的基線波動，使基線更加平滑。至于流動相B到底是否是選擇純的有機(jī)相還是選擇一定比例的有機(jī)相例如（80%、90%的甲醇或乙腈）要根據(jù)實(shí)驗(yàn)去做選擇。
本人推薦用一定比例的有機(jī)相為流動相B。因?yàn)樵诩尤爰兊囊译婊蛘呒状嫉扔袡C(jī)相時(shí)，由于兩相在混合時(shí)會有吸熱或放熱的反應(yīng)，會有很大的基線波動，用一定比例的有機(jī)相作為B相可以有效地減小流動相沖擊效應(yīng)。
原則二：有機(jī)相加入梯度梯度盡量緩
以下為筆者自己的一個(gè)實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目，在進(jìn)行梯度方法摸索時(shí)的一個(gè)案例，
梯度方法25洗脫程序
梯度方法26洗脫程序
梯度方法27洗脫方式
梯度方法27洗脫方式
梯度洗脫程序的比較可以看出，緩慢的加入有機(jī)相可以使梯度峰更加平滑，使各雜質(zhì)峰的分離度更好。
關(guān)于梯度鬼峰的出現(xiàn)，如果純的緩沖鹽相與有機(jī)溶劑相相互混合時(shí)，會有很大的互溶沖擊效應(yīng)的出現(xiàn)，這時(shí)候即使安裝市面上的比較常用的鬼峰捕集小柱，基線依然不是很平滑；所以我推薦用混合一定比例的有機(jī)相與鹽相的溶液作為混合鹽相，將混有一定比例水的有機(jī)相的混合液作為梯度洗脫的有機(jī)相，配合鬼峰捕集小柱的使用可以使基線更加平滑。
05
緩沖鹽的選擇
首先要明白為什么要加入緩沖鹽，緩沖鹽的作用之一是為了增加流動相的緩沖能力。一般常見的無機(jī)緩沖鹽（磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、磷酸二氫氨、乙酸銨等）的作用是為了調(diào)整流動相的緩沖能力；
何為緩沖能力？緩沖能力是指在其他溶液或者物質(zhì)加入到流動相后，流動相pH變化程度的大小，流動相的pH變化越小證明流動相的緩沖能力越強(qiáng)，反之越弱。在一些標(biāo)準(zhǔn)上可以看到同一流動相的配置過程中需要使用的緩沖鹽有兩種，這是因?yàn)槭褂脧?fù)合鹽作為流動相比使用單一的鹽作為流動相的緩沖能力強(qiáng)。有些待測主成分在中性或者堿性的環(huán)境中容易水解，例如帶-OH的基團(tuán)，容易在中性、堿性環(huán)境中水解，在圖譜上表現(xiàn)為雙頭峰。為防止這種類型的水解，可以加入磷酸鹽用磷酸調(diào)節(jié)pH至酸性環(huán)境，從而抑制水解。
加入緩沖鹽的另外作用是為了增加待測成分的保留時(shí)間，通常帶有氨基的物質(zhì)或者氨根的物質(zhì)如-、-NHR、-等基團(tuán)時(shí)，為了增加該物質(zhì)的保留，可以添加-（硫酸基）的離子對試劑如戊烷磺酸鈉、辛烷磺酸鈉，以增強(qiáng)保留。
一般來說緩沖鹽是不會出峰的，我曾經(jīng)用pH調(diào)為3.0的水為流動相與用磷酸二氫鉀為緩沖鹽pH調(diào)為3.0的水溶液作為流動相，兩者圖譜出來的梯度峰吻合度非常好，所以各位同仁不必?fù)?dān)心緩沖鹽會造成梯度峰。造成梯度峰的直接原因是流動相混合沖擊。
06
檢測波長的選擇
關(guān)于檢測波長的選擇，需要結(jié)合多個(gè)雜質(zhì)的紫外吸收圖譜去綜合考量，最好選擇紫外吸收特征圖譜上波峰處的波長作為檢測波長，但是也要兼顧其它雜質(zhì)在該波長下是否有紫外吸收。
3個(gè)雜質(zhì)的最大吸收分別為203.3、204.5、204.5nm，同時(shí)在205~230nm這個(gè)范圍內(nèi)也可以作為次選波長。所以綜合考慮該三個(gè)雜質(zhì)的檢測波長可以暫定為205nm。
波長選擇需要注意的點(diǎn)：190~210nm這個(gè)范圍內(nèi)的波長慎重選擇，該波段的波長屬于低波段，受到的干擾比較多，尤其是受流動相中試劑的純度影響較大。如果遇到試劑不純或者水質(zhì)不好時(shí)，就會有一個(gè)類似梯度峰的“峰”出現(xiàn)，此類峰往往比較平滑，并不像真正雜質(zhì)的峰那樣尖銳，同時(shí)表現(xiàn)為無論如何調(diào)整梯度洗脫程序，始終在特定的位置“出峰”。如果該“峰”恰巧影響雜質(zhì)出峰，那么消除起來就非常難了。
筆者曾經(jīng)遇到的一個(gè)項(xiàng)目就被這種峰糾纏了好久，后來通過更換更高級別的試劑、更純凈的水、多次沖洗儀器、色譜柱，逐步排除后才解決問題，我曾試驗(yàn)過，用DAD檢測器選用265nm、225nm、205nm分別作為檢測波長，該“峰”在265nm、225nm不會出現(xiàn)，所以205這個(gè)波長慎重選擇。
07
溶劑的選擇
如果用等度洗脫，首選用流動相作為溶劑，一般直接用流動相為稀釋劑已經(jīng)足夠滿足日常分析要求。但對于梯度洗脫方式，最好選擇與初始梯度濃度相近溶液作為溶劑；但是不管是等度還是梯度洗脫，都要需要考慮以下幾點(diǎn)：
第一是溶劑對樣品的溶解能力，如果所選的溶劑對樣品的溶解能力不足，輕則不出峰，重則堵儀器、色譜柱。
第二是需要考慮溶劑出峰是否會對目標(biāo)峰的分離造成影響，如果溶劑峰影響目標(biāo)峰出峰，那么所選的溶劑肯定是不合適的。對于梯度洗脫溶劑的選擇，可以通過逐步調(diào)節(jié)溶劑中有機(jī)相與鹽相的比例，觀察圖譜來選擇合適的溶劑，同時(shí)要注意溶劑的pH、緩沖能力要盡可能的與流動相相當(dāng)。
我們一直說的溶劑峰到底是個(gè)什么鬼？很多同仁做了很多年實(shí)驗(yàn)也沒有真正的搞清楚，溶劑峰是由于溶劑中有機(jī)相與初始流動相中有機(jī)相的不同，二者在進(jìn)樣后由于其極性不一樣，在同一波長下吸光度不一樣而導(dǎo)致的“出峰”，一般通過改變測定波長可以掩蔽溶劑峰的出現(xiàn)與否。
當(dāng)然在實(shí)際的分析方法開發(fā)中，很多人覺得溶劑的選擇不是那么重要，往往忽視溶劑的重要性。下面是我做的一個(gè)項(xiàng)目中，由于溶劑選擇不當(dāng)，引發(fā)的一個(gè)慘案。
不同的比例的流動相A與B混合出來的溶劑梯度峰是有差別的，在前期試驗(yàn)時(shí)，要盡可能多試幾種不同濃度或種類溶劑，綜合去考慮應(yīng)該考慮哪種溶劑作為最終的溶劑。
