粗硬黑大欧美aaaa片视频_国产精品视频区1_日韩综合精品视频_天堂网www在线资源_日韩精品中文字幕视频_无码爽大片日本无码AAA特黄

食品伙伴網服務號
當前位置: 首頁 » 檢驗技術 » 培訓資料及講義 » 正文

雙向電泳的實驗過程

放大字體  縮小字體 發布日期:2013-06-19  來源:生物無憂
核心提示:實驗原理2-DE的第一向電泳等電聚焦是基于等電點不同而將蛋白粗步分離,第二向SDS-PAGE是基于蛋白質分子量不同,而將一向分離后的
 實驗原理
2-DE的第一向電泳等電聚焦是基于等電點不同而將蛋白粗步分離,第二向SDS-PAGE是基于蛋白質分子量不同,而將一向分離后的蛋白進一步分離。這樣就可以得到蛋白質等電點和分子量的信息。
主要試劑
1. BSA
2. Bradford液
3. DTT 
4. 0.05% 的溴酚蘭 
5. IPG buffer (pH 3-10)
主要設備
1. 振蕩器
2. 高速離心機
3. 紫外分光光度計
4. 雙向電泳設備
實驗材料
純化后的晶體蛋白
實驗步驟
1. 樣品的溶解
    取純化后的晶體蛋白3.0mg,加入300ul裂解液(1mg蛋白:100ul裂解液)振蕩器上振蕩10min左右,共處理一個小時。其中每隔10~15分鐘振蕩一次,然后13200rpm離心15min除雜質,取上清分裝,每管70ul,-80oC保存。
2. Bradford法測蛋白含量
    取0.001g BSA(牛血清白蛋白)用1ml超純水溶解,測定BSA標準曲線及樣品蛋白含量。
    取7個10ml的離心管,首先在5個離心管中按次序加入0ul, 5ul, 10ul, 15ul, 20ul 的BSA溶解液,另2管中分別加入2 ul的待測樣品溶液,再在每管中加入相應體積的雙蒸水(總體積為80ul),然后,各管中分別加入4ml的Bradford液(原來配好的Bradford液使用前需再取需要的劑量過濾一遍方能使用),搖勻,2min在595nm下,按由低到高的濃度順序測定各濃度BSA的OD值,再測樣品OD值。(測量過程要在一個小時內完成)。例如:
編號        蛋白量(ul)         Buffer(ul)         Bradford(ml)       OD595值
1                0                   80                4                0
2                5                   75                4               0.024
3               10                   70                4               0.061
4               15                   65                4               0.091
5               20                   60                4               0.116
Bt4              2                   78                4               0.079
Bt4              4                   76                4        
轉Bt4            2                   78                4               0.075
轉Bt4            4                   76                4        
標準曲線方程式:Y= aX b.其中Y為 OD值,X為蛋白含量。 a、b通過作圖輸入數據可知,相關系數通過輸入數據,作圖,軟件分析可得。
OD值測量過程:
    比色皿用70%的乙醇保存,待用時用雙蒸水沖洗,再用無水乙醇沖洗,雙蒸水沖洗,再加入待測樣品溶液潤洗,然后,加入樣品,測定OD值。
3. 雙向電泳第一向---IEF(雙向電泳中一律使用超純水)
   1) 水化液的制備
稱取2.0mg 的DTT,用700ul水化液儲液溶解后,加入8ul 0.05% 的溴酚蘭,3.5ul(0.5%v/v)IPG buffer (pH 3-10)振蕩混勻,13200rpm離心15min 除雜質,取上清。在含300ug 蛋白(經驗值)的樣品溶解液中加入水化液,至終體積為340ul,振蕩器上振蕩混合,13200rpm離心15min除雜質,取上清。 
   2) 點樣,上膠
分兩次吸取樣品,每次170ul, 按從正極到負極的順序加入點樣槽兩側,再用鑷子撥開Immobiline  DryStrip gels (18cm,pH 3-10)膠條,從正極到負極將膠條壓入槽中,膠面接觸加入的樣品。注意:膠條使用前,要在室溫中平衡30分鐘;加樣時,正極要多加樣,以防氣泡的產生;壓膠時不能產生氣泡;酸性端對應正極,堿性端對應負極;樣品加好后,加同樣多的覆蓋油(Bio-Rad),兩個上樣槽必須與底線齊平。
   3)  IPG聚焦系統跑膠程序的設定(跑膠溫度為20oC)
S1 (30v, 12hr, 360vhs, step)
S2 (500v, 1hr, 500vhs, step)
S3 (1000v, 1hr, 1000vhs, step)
S4 (8000v, 0.5hr, 2250vhs, Grad)
S5 (8000v, 5hr, 40000vhs, step)       共計44110vhs, 19.5小時,其中S1用于泡脹水化膠條,S2和S3用于去小離子,S4和S5用于聚焦。
   4) 平衡
用鑷子夾出膠條,超純水沖洗后,在濾紙上吸干(膠面,即接觸樣品那一面不能接觸濾紙,如果為18cm的膠條要將兩頭剪去),再以超純水沖洗,濾紙吸干(再次沖洗過程也可省略),然后用鑷子夾住膠條以正極端(即酸性端)向下,負極端(即堿性端)向上,放入用來平衡的試管中(鑷子所夾的是堿性端,酸性端留有溴酚蘭作為標記),用平衡液A,平衡液B先后平衡15min。  注:平衡時要注意保持膠面始終向上,不能接觸平衡管壁。
平衡第二次時,在沸水中煮Marker 3min,剪兩個同樣大小的小紙片,長度與一向膠條的寬度等同,然后吸取煮好的Marker,轉入SDS—PAGE膠面上,保持緊密貼合;同樣在第二次平衡時,煮5%的瓊脂糖10ml。
4. 雙向電泳第二向---SDS-PAGE 
   1) 配膠(兩根膠條所用劑量)
分離膠:(T=8%  80 ml):溶液于真空機中抽氣后再加APS和TEMED
30 % 丙烯酰胺儲液    21.28ml
分離膠buffer          20ml      10%APS 220ul     TEMED 44 ul 
雙蒸水               38.72ml 
濃縮膠:(T=4.8%   10ml)
30 % 丙烯酰胺儲液    1.6ml 
濃縮膠buffer          2.5ml     10%APS 30ul     TEMED 5ul 
雙蒸水               5.9ml
   2) 灌膠
    將玻璃板洗凈后,室溫晾干,然后,將電泳槽平衡好,玻璃板夾好,再在玻璃板底部涂上凡士林以防漏膠,倒入正丁醇壓膠,凝膠后(這時會出現三條線),用注射器吸去正丁醇,超純水洗兩次,再用濾紙除水后,倒入濃縮膠,正丁醇壓膠,凝膠后,用注射器吸去正丁醇,超純水洗兩次,再加入超純水,用保險膜封好。
   3) 轉移
    剪兩個小的濾紙片,吸取Marker后,放入SDS—PAGE膠面的一端。然后,將平衡好的IPG膠條貼靠在玻璃板上,加少量的5%的瓊脂糖溶液在膠面上(瓊脂糖凝膠在轉移前十幾分鐘的時候配好,水浴加熱溶解,并保持燒杯中水處于沸騰狀態,至用之前再拿出來),再將IPG膠條緩緩加入SDS—PAGE膠面,其中不斷補加5%的瓊脂糖溶液,注意不能產生氣泡。
   4) 跑膠
濃縮膠  13mA         分離膠  20mA        共約5.5個小時。
5. 銀染(兩根膠條所用劑量)(銀染特別注意用超純水)
   1)  固定   30min    無水乙醇 200ml 乙酸50ml,用超純水定容至500ml。
   2)  敏化   30min    無水乙醇 150ml。
Na2S2O3•5H2O  1.5688g
無水乙酸鈉          34g  
先用水溶解Na2S2O3•5H2O和乙酸鈉,再加乙醇,最后定容至500ml。
   3)  洗滌   5min  ×  3次
   4)  銀染   20min     AgNO3   1.25g   用超純水定容至500ml
   5)  洗滌   1min  ×  2次
   6)  顯影       
無水Na2CO3    12.5g   用超純水定容至500ml,甲醛(37%)0.1ml, 臨時加。
   7)  終止   10min     EDTA—Na2•2H2O  7.3g  用超純水定容至500ml。
   8)  洗滌   5min  ×  3次。
注意事項
整個雙向電泳實驗中全部使用超純水,盡量減少離子的影響。

編輯:songjiajie2010

 
分享:
關鍵詞: 雙向電泳 實驗過程
[ 網刊訂閱 ]  [ 檢驗技術搜索 ]  [ ]  [ 告訴好友 ]  [ 打印本文 ]  [ 關閉窗口 ] [ 返回頂部 ]
 

 
 
推薦圖文
推薦檢驗技術
點擊排行
檢驗技術
 
 
Processed in 0.087 second(s), 13 queries, Memory 0.94 M
主站蜘蛛池模板: 91大片淫黄大片在线天堂|国内国产精品久久|91cc.live最新国产|成人=aⅴ视频|v=a在线|国产成人免费视 | 一本到亚洲网|99久久精品国产欧美主题曲|973理论片235影院|国产一区二区高清在线|亚州国产视频|国产精品一卡二卡三卡 | 久热超碰|免费人成激情视频在线观看|日本字幕有码中文字幕|久久网国产精品|亚洲最大成人网站|国产操逼视频 | 性开放少妇xxxxⅹ视频蜜桃|成人深夜福利视频在线观看|依人久久久|葵司在线视频|不卡视频在线|免费看黄色大片 | 美国=a级黄色大片|国内露脸少妇精品视频|日本免费在线一区|欧美一区影院|高清黄色毛片|在线中文一区 | 国产精品久久久久久久久久久久久久久久久|免费无遮挡无码永久在线观看视频|一个人在线观看免费视频www|欧美性猛交xxxx乱大交丰满|久久无码人妻一区二区三区午夜|色欲香天天天综合网站无码 | 欧美做爰爽爽爽爽爽爽|国内揄拍国内精品|天天澡天天摸天天添视频|84c=aocom最新网站|69堂在线观看|天天澡天天狠天天天做 | 爆乳肉体大杂交SOE646在线|51vv社区视频在线视频观看|中文视频在线观看|国产网红=av|久久婷婷五月综合色奶水99啪|国产一级淫片免费 | 亚洲精品久久久久久蜜臀|老熟妇性老熟妇性色|黄色一级片片|国产二区一区|极品少妇xxxxx|日日摸夜夜爽无码毛片精选 | 91精品国产综合久久香蕉最新版|久久97久久|国产福利三区|华人在线视频|mm1313美女视频|一区二区免费播放 | 欧美一区二不卡视频|片多多免费观看|成人午夜精品无码一区二区三区|国产目拍亚洲精品二区|午夜婷婷|伊人春色在线观看 | 冥王星之恋泰剧在线观看|国产亚洲精品=a片久久久|日韩大片免费在线观看|免费无码=aV片在线观看网址|最新精品国偷自产在线|国产偷人激情视频在线观看 | 荡乳欲妇在线观看|小次郎=av收藏家|国产亚洲日韩在线=a不卡|亚洲天堂久久久久久久|国产精品福利在线播放|国产成人无码=a片免费 | 国产成=a人亚洲精v品在线观看|色之久久综合|情欲综合网|久草免费在线色站|在线高清视频|国产快猫视频在线看免费 | 美国=a级黄色大片|国内露脸少妇精品视频|日本免费在线一区|欧美一区影院|高清黄色毛片|在线中文一区 | 久久99香蕉|中国XXX农村性视频|亚洲=aV日韩=aV男人的天堂在线|国产v亚洲v天堂=a|亚洲|这里只有精品在线播放|三年片在线视频中国 | 秋霞福利视频|亚洲精品1234区|国产一级久久久久|在线91|国产做=a爱片久久毛片=a片|天天爱天天做天天做天天吃中文 | 爱操=av|亚洲欧美人成视频一区在线|女同性爽爽爽免费观看|久久久久亚洲国产精品|熟女精品视频一区二区三区|极品新婚夜少妇真紧 | 少妇大战黑吊在线观看|淫片毛片视频|日本精品www|国产成人久久精品77777|亚洲国产欧美在线观看的|国产精品色情国产三级在 | 青青草青青操|www.jjzz日本|最近中文字幕完整视频高清|91影院在线观看视频|国产精品水嫩水嫩|男女夜色爽爽影院 | 免费三级网|看毛片网站|午夜影剧院|国产农村一级一级毛片|十八禁g=ay网站|精品国产乱码久久久久久蜜臀网站 | 久久亚色|久99久精品免费视频热|欧美人伦禁忌DVD放荡欲情|幻女free性俄罗斯毛片|国产精品一区二区三区免费观看|亚洲精品乱码久久久久久中文字幕 | l礼香的真实|99久久99九九99九九九|精品日产一区二区三区视频怎么看|18禁黄无码免费网站高潮|亚洲成=av在线|色狠狠=aV老熟女 | 99视屏|亚洲精品日韩专区|欧美一级国产|久久丫不卡人妻内射中出|欧美日韩另类综合|亚洲色无码=a片中文字幕 | 日本成熟少妇喷浆视频|女性裸体啪啪无遮挡免费网站|99色热|日日夜夜草|99re在线视频播放|夜夜操=av | 国产高清精品亚洲а∨|一本久道久久综合狠狠爱亚洲精品|久久国产福利|久久久久www|无码人妻精品一区二区三区99不卡|亚V=a芒果乱码一二三四区别 | 成人极品影院|久久综合亚洲色hezyo国|www.在线视频|奇米777四色精品综合影院|土壤污染状况调查|人人草人人插 | www.超碰在线.com|日本在线观看无码不卡V|免费观看日本污污ww网站|一区2区|91福利区|国产精品久久久久久238 | 婷婷综合缴情亚洲狠狠|日日夜夜操视频|三级在线中文字幕|日本精品免费在线观看|日产国产亚洲精品系列|国产高欧美性情一线在线 | 日韩性精品|一级黄色视|www.日本在线视频|鲁一鲁亚洲无线码|凸输偷窥xxxx自由免费视频|97人妻人人揉人人躁人人 | 在线看免费观看=av|十九岁大学生日本在线播放|91在线看视频|欧美日韩国产综合新一区|韩日黄色毛片|刘亦菲精品国产亚洲人成 | 亚洲日本乱码一区二区产线一∨|我要看WWW免费看插插视频|老师课后辅导乳揉搓H在线观看|视频一区二区三区波多野结衣|中文字幕在线资源|精品国产第一页 | 2019久久久|91女同|#NAME?|亚洲福利在线视频|国产猛烈高潮尖叫视频免费|久久精品国产72国产精 | 69视频在线观看|不卡的=av在线播放|羞羞色男人的天堂|蜜臀=av夜夜澡人人爽人人|一区二区三区黄|成年人在线免费网站 色一色成人网|久草在线影|精品视频在线观看99|国产香蕉尹人视频在线|亚洲=a∨好看=av高清在线观看|亚洲欧美日本在线 | 性夜夜春夜夜爽=a=a片=a|欧美激情在线观看视频免费的|女人16一级毛片|日韩精品视频在线观看一区二区|欧美亚洲国产成人|hhh在线观看 | 新91在线视频|蜜臂精品国产高清在线观看|日韩国产黄色片|亚洲精品永久入口|国产成人午夜福利免费无码R|欧美不卡一区二区三区 | 野花社区WWW在线全网|久久在线观看|日本久操|久久黄色小说|亚洲=aV无码一区东京热久久|成人无码小视频在线观看 | 欧美区二区三区|大美女一区二区三区|午夜国产精品影院在线观看|日本丰满人妻久久久久久久|99视频精选|丰满人妻熟妇乱又伦精品劲 | 最新精品国偷自产在线老年人|国产青涩|日韩精品久久久久|九九99久久精品国产|亚洲=aV无码有乱码在线观看|91精选视频在线观看 | きょこんきょうしゃ在线|91狠狠爱|亚洲=aV日韩综合一区尤物|丝袜亚洲另类欧美变态|GOGOGO高清在线观看|亚洲=aV成人无码精品综合网站 | 亚洲精品网站在线观看|国产精品美女久久福利网站|久久xxxx|亚洲精品精品|国产激情99|国产高清无码日韩一区 |