復(fù)雜,含鹽或其他污染物

易被蛋白酶降解

動態(tài)范圍寬（>X106）

溶解性不均一（疏水性/親水性）

分子量、等電點(diǎn)的范圍寬（10-500KDa,pH2-14）

2、樣品分離的基本要求：

高靈敏度和分辨率

寬動態(tài)范圍

小樣品體積

高通量

合適的溫度和pH

避免蛋白酶降解

適合與高靈敏度的質(zhì)譜聯(lián)用

盡量少的操作步驟減少污染和損失

3、樣品緩沖液的組成：

3.1 尿素：一種中性變性劑,破壞氨基酸殘基之間的非共價(jià)鍵和離子鍵而不影響等電聚焦,濃度范圍5-9.8mol/L,溶液不穩(wěn)定,降解生成的氰酸根離子與蛋白質(zhì)的氨基結(jié)合改變蛋白質(zhì)的等電點(diǎn).加精胺能降低影響.

3.2 硫尿：與尿素一起,能增加疏水膜蛋白的溶解性,缺點(diǎn)是在平衡液里與蛋白的半胱氨酸競爭結(jié)合碘代乙酰胺,會使蛋白的烷基化不完全,硫尿還有抑制SDS與蛋白質(zhì)結(jié)合的作用,也可能增加脂類的溶解性,影響二向的效果.一般是2mol/L的硫尿與5-7mol/L尿素結(jié)合使用.

3.3 去污劑：蛋白質(zhì)在去折疊后,會暴露出大量的疏水性殘基,去污劑用于破壞蛋白質(zhì)分子間的疏水相互作用.陰離子去污劑SDS,不利于穩(wěn)定等電聚焦中蛋白質(zhì)的等電點(diǎn),濃度不超過0.25%,

    NP-40：SDS>=8：1,常用的有非離子型去污劑Triton X-100和NP-40,兩性離子去污劑CHAPS,SB3-10等.非離子型去污劑和兩性離子去污劑能在不破壞蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu),保持生物活性的情況下改善蛋白質(zhì)的溶解度,但是必須選擇合適的濃度,濃度太低不能改善蛋白質(zhì)的溶解性,濃度太高會使蛋白帶變寬,影響分辨率和引起紋理現(xiàn)象.各種去污劑結(jié)合使用濃度范圍0.5-4%.

3.4 還原劑：還原劑能打開蛋白質(zhì)的二硫鍵.一般使用β-巰基乙醇、二硫蘇糖醇（DTT）和二硫赤蘚糖醇（DTE）,DTT和DTE本身帶有電荷,在等電聚焦時會遷移到pH范圍以外,從而使某些蛋白質(zhì)的二硫鍵重新配對使溶解度降低而重新沉淀下來.一般的濃度范圍10-100mmol/L,非離子型還原劑如三丁基膦（TBP）2mmol/L能增加蛋白質(zhì)的溶解性,并可幫助蛋白質(zhì)從第一向轉(zhuǎn)移到第二向.不過TBP有劇毒,操作時應(yīng)相當(dāng)小心,并做好防護(hù)工作.

3.5 載體兩性電解質(zhì)：它有兩個基本特性,一是兩性的,能夠在分離柱中達(dá)到一個平衡位置,二是可以作為“載體”,能夠“運(yùn)載”電流和pH能力.Biolyte是在丙烯乙胺與乙烯亞胺縮合并蒸餾得到的多胺混合物中再引入磺酸基團(tuán)或磷酸基團(tuán)后合成的.其他特性是分子量小,可溶性好,緩沖能力強(qiáng),導(dǎo)電性均勻,紫外吸收低,不發(fā)熒光,無毒、無生物學(xué)效應(yīng),具有螯合性質(zhì).所有載體兩性電解質(zhì)分子都荷電,只是在溶液中荷正電和荷負(fù)電是相等的,所以總的凈電荷為零,當(dāng)引入電場時,載體兩性電解質(zhì)分子將向陰極和陽極移動,當(dāng)它達(dá)到凈電荷是零的位置時才停止從而給出一個pH梯度.也必須選用合適的濃度,一般使用的濃度范圍是 0.2-2%.

3.6 蛋白酶抑制劑：蛋白酶抑制劑能夠暫時或者永久性的破壞蛋白酶的活性,減少蛋白質(zhì)被降解和修飾的可能性.

3.7 DNase I 和RNase A.消化DNA和RNA,減少污染.