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Western blot常見問題及注意事項(一)

放大字體  縮小字體 發布日期:2024-11-14  來源:上海撫實實業
核心提示:1、我的細胞提取液有的有沉淀,有的很清亮,為什么呢?答:有沉淀可能因為你的蛋白沒有變性全,可以適當提高SDS 濃度,同時

1、我的細胞提取液有的有沉淀,有的很清亮,為什么呢?
答:有沉淀可能因為你的蛋白沒有變性全,可以適當提高SDS 濃度,同時將樣品煮沸時間延長; 也不排除你的抗原濃度過高,這時再加入適量上樣緩沖液即可。

2、我做的蛋白質分子量很小(10
kd),請問怎么做WB?
答:可以選擇0.2μm的膜,同時縮短轉移時間。也可以將兩張膜疊在一起,再轉移。

3、最后顯色時用 DAB好還是ECM好?
答:DAB有毒,但是比較靈敏,是HRP最敏感的底物;ECM結果容易控制,但被催化時靈敏度差一點,但如果達到閥值,就特別靈敏,可以檢測pg 級蛋白,具體可以根據你實驗的情況。

4、要驗證某個細胞上有無該蛋白的存在,需要做免疫組化和
Western Blot試驗嗎?做這兩個試驗時的一抗和二抗可以共用嗎?
答:
①免疫組化可以用來進行定位,但是不能精確定量,而且有時會有假陽性,不易與背景區分;Western blot可以特異性檢測某個蛋白質分子,進行定 量,但是不能定位。
②兩種實驗的一抗有時候不能通用,公司的產品說明一般都會說明可以進行什么實驗,在免疫組化時,是否適合石蠟切片或者冰凍切片。

5、細胞水平要做
Western Blot,多少細胞提的蛋白夠做Western Blot
答:一般5×106就足夠了。

6、同一樣品能同時提RNA又提蛋白么?這樣對
Western Blot有無影響?
答:能,沒有問題。

7、同一蛋白樣品能同時進行兩種因子的Western Blot檢測嗎?
答:當然可以,有的甚至可以同時測幾十種樣品。

8、蛋白變性后可以存放多久?
答:-80℃,一兩年沒有問題。最關鍵兩條:不要被蛋白酶水解掉;不要被細菌消化掉(也是被酶水解了)。

9、二抗是生物素化的抗體,三抗是親和素生物素體系,不知采用這樣的方案后,封閉液是否要作調整,能否再用5%的脫脂奶粉呢?
答:不能使用脫脂奶粉,因為脫脂奶粉中含生物素,用BSA代替應該好一點。

10、做組織樣品的
Western Blot的時候,怎樣處理樣品?
答:必須進行研磨、勻漿、超聲處理,蛋白質溶解度會更好,離心要充分,膜蛋白需用更劇烈的方法抽提,低豐度膜蛋白可能還要分步抽提(超速離心)。還有一點就是組織中的蛋白酶活性更強,需要注意抑制蛋白酶的活性。

11、免疫組化和Western Blot可以用同一種抗體嗎?
答:免疫組化時抗體識別的是未經變性處理的抗原決定簇(又稱表位),有些表位是線性的,而有的屬于構象型;線性表位不受蛋白變性的影響,天然蛋白和煮后的蛋白都含有;構象型表位由于受蛋白空間結構限制,煮后變性會消失。如果你所用的抗體識別的是蛋白上連續的幾個氨基酸,也就是線性表位,那么這種抗體可同時用于免疫組化和Western,而如果抗體識別構象形表位,則只能用于免疫組化。

12、在做Western Blot時,PVDF膜用甲醇浸泡的目的?
答:PVDF膜用甲醇泡的目的是為了活化PVDF膜上面的正電基團,使它更容易跟帶負電的蛋白質結合,做小分子的蛋白轉移時多加甲醇也是這個目的。

13、檢測同一抗體的磷酸化和非磷酸化的抗原可以在同一張膜上嗎?
答:可以。

14、蛋白質的分子量跨度很大,如要分離小21
kd,中至66kd,大至170kd,可以一次做好嗎?
答:這么廣的分布不好轉移,一般建議:21kd和66kd可以一起轉,12%SDS-PAGE,濕轉120mA, 45-60min就可以了, 可以根據你實驗室的經驗調節;170kd 用 7% SDS-PAGE,200mA 90-120min。

15、細胞裂解液選擇蛋白酶抑制劑時有什么原則嗎?受不受組織來源的影響?胞膜和胞漿有區別嗎?
答:一般來說提取時加入廣譜的蛋白酶抑制劑就可以了,操作時保持低溫。若有特殊要求可以選擇相應的蛋白酶抑制劑。

編輯:songjiajie2010

 
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