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聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）是體外酶促合成特異DNA片段的一種方法，為常用的分子生物學(xué)技術(shù)之一。其基本步驟是，首先將待擴(kuò)增的模板DNA變性使之成為單鏈，DNA樣品中，特異性的引物能夠與其互補(bǔ)的序列雜交，在dNTPs和Taq酶存在時(shí)，就可以合成模板DNA的互補(bǔ)鏈，反應(yīng)完成后，將反應(yīng)混合物加熱使DNA雙鏈變性，溫度下降后，過量的引物又可以開始第二輪的合成反應(yīng)。這種延伸-變性-退火-延伸的循環(huán)可以重復(fù)多次，使所需要的DNA片段得到特異性的擴(kuò)增。
PCR引物設(shè)計(jì)的目的是為了找到一對(duì)合適的核苷酸片段，使其能有效地?cái)U(kuò)增模板DNA序列。因此，引物的優(yōu)劣直接關(guān)系到PCR的特異性與成功與否。
要設(shè)計(jì)引物首先要找到DNA序列的保守區(qū)。同時(shí)應(yīng)預(yù)測將要擴(kuò)增的片段單鏈?zhǔn)欠裥纬啥?jí)結(jié)構(gòu)。如這個(gè)區(qū)域單鏈能形成二級(jí)結(jié)構(gòu)，就要避開它。如這一段不能形成二級(jí)結(jié)構(gòu)，那就可以在這一區(qū)域設(shè)計(jì)引物。
現(xiàn)在可以在這一保守區(qū)域里設(shè)計(jì)一對(duì)引物。一般引物長度為15~30堿基，擴(kuò)增片段長度為100~600堿基對(duì)。讓我們先看看P1引物。一般引物序列中G+C含量一般為40%~60%。而且四種堿基的分布最好隨機(jī)。不要有聚嘌呤或聚嘧啶存在。否則P1引物設(shè)計(jì)的就不合理。應(yīng)重新尋找區(qū)域設(shè)計(jì)引物。同時(shí)引物之間也不能有互補(bǔ)性，一般一對(duì)引物間不應(yīng)多于4個(gè)連續(xù)堿基的互補(bǔ)。
引物確定以后，可以對(duì)引物進(jìn)行必要的修飾，例如可以在引物的5′端加酶切位點(diǎn)序列；標(biāo)記生物素、熒光素等，這對(duì)擴(kuò)增的特異性影響不大。但3′端絕對(duì)不能進(jìn)行任何修飾，因?yàn)橐锏难由焓菑?′端開始的。這里還需提醒的是3′端不要終止于密碼子的第3位，因?yàn)槊艽a子第3位易發(fā)生簡并，會(huì)影響擴(kuò)增的特異性與效率。
綜上所述我們可以歸納十條PCR引物的設(shè)計(jì)原則：
①引物應(yīng)用核酸系列保守區(qū)內(nèi)設(shè)計(jì)并具有特異性。
②產(chǎn)物不能形成二級(jí)結(jié)構(gòu)。
③引物長度一般在15~30堿基之間。
④G+C含量在40%~60%之間。
⑤堿基要隨機(jī)分布。
⑥引物自身不能有連續(xù)4個(gè)堿基的互補(bǔ)。
⑦引物之間不能有連續(xù)4個(gè)堿基的互補(bǔ)。
⑧引物5′端可以修飾。
⑨引物3′端不可修飾。
⑩引物3′端要避開密碼子的第3位。
