在微生物鑒定中，革蘭氏染色應該是最初接觸的一種區分細菌的實驗方法。通過革蘭氏染色鑒定后，區分出革蘭氏陽性菌和陰性菌，憑借結果以作后續的鑒定分離細菌。可以說，革蘭氏染色在微生物研究過程中，是一個應該掌握的技術。
1.細菌的細胞壁

要了解革蘭氏染色的原理，先了解細菌的細胞壁：

細菌的細胞壁主要由肽聚糖組成，能夠固定細胞外形和保護細胞不受損傷，其主要功能包括：

特定的抗原性以及抵御抗生素、噬菌體的能力；

固定細胞外形以及提高機械強度，避免外力的損傷；

是細胞生長、分裂和運動（主要是有鞭毛的細菌）的必需構造；

阻擋大分子物質（對生命活動有危害或潛在危害的物質）進入細胞。

2.細菌細胞壁的差異

細菌細胞壁除了含有肽聚糖，還有其它組分，這些組分是革蘭氏陽性菌和陰性菌所不同的。

革蘭氏陽性菌的細胞壁主要由60%-95%的肽聚糖組成，還有10%-30%磷壁酸；陰性菌的細胞壁與陽性菌細胞壁相比較，雖然厚度相對薄，但是成分復雜，除了肽聚糖外，還有一層由脂多糖、磷脂和若干外膜蛋白組成的外膜結構。

革蘭氏陽性菌與陰性菌細胞壁的主要差異如下：

肽聚糖層：陽性菌的較厚且層次多，陰性菌的為單層且薄；

外膜：只有陰性菌存在外膜結構，包括了脂多糖和類脂；

磷壁酸：多數陽性菌都有磷壁酸，陰性菌不存在磷壁酸；

對機械力的抗性：陽性菌抗機械力的能力強于陰性菌；

抗溶菌酶的能力：陰性菌抗溶菌酶的能力優于陽性菌。

3.革蘭氏染色的機制

革蘭氏染色以細菌細胞壁化學成分的差異引起脫色能力的不同為基礎，即，細菌能否將染色劑阻礙在細胞壁中的原理，進行區分陽性菌和陰性菌，其結果為：陽性菌的細胞壁能夠將染色劑結晶紫阻留而染成紫色；陰性菌的細胞壁不能將染色劑阻留，經過復染后形成紅色。

經過結晶紫初染和碘液媒染后，在細胞壁內形成結晶紫與碘的復合物，該復合物不溶于水。陽性菌因為細胞壁較厚、肽聚糖層多和交聯致密，且不含類脂，當乙醇/丙酮進行脫色處理時，肽聚糖網層結構因失水導致網孔變小，結晶紫與碘的復合物就被阻留在細胞壁中。

陰性菌因為細胞壁較薄，且外膜層類脂物質含量高，受到乙醇/丙酮作用，細胞壁結構發生改變，外膜的類脂溶解，肽聚糖網層不能夠將結晶紫與碘的復合物阻留，重新恢復為無色的狀態，然后經過沙黃等紅色染劑的復染形成紅色。

4.革蘭氏染色的操作

革蘭氏染色的基本步驟如下：

固定：涂片干后加熱固定，火焰固定時涂片膜朝上，以中等速度越過火焰3次，或使用乙醇/甲醇固定；

初染：滴加結晶紫染液，1分鐘，清水洗去染液；

媒染：加碘液，1分鐘，水洗；

脫色：加脫色液，搖動10-30秒，至無紫色脫落，水洗；

復染：加復染液，30秒，水洗；

鏡檢：涂片干后鏡檢。