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Folin—酚試劑法(Lowry法)
(一)實驗原理
這種蛋白質測定法是最靈敏的方法之一.過去此法是應用最廣泛的一種方法,由于其試劑乙的配制較為困難(現在已可以訂購),近年來逐漸被考馬斯亮蘭法所取代.此法的顯色原理與雙縮脲方法是相同的,只是加入了第二種試劑,即Folin—酚試劑,以增加顯色量,從而提高了檢測蛋白質的靈敏度.這兩種顯色反應產生深蘭色的原因是:在堿性條件下,蛋白質中的肽鍵與銅結合生成復合物.Folin—酚試劑中的磷鉬酸鹽—磷鎢酸鹽被蛋白質中的酪氨酸和苯丙氨酸殘基還原,產生深蘭色(鉬蘭和鎢蘭的混合物).在一定的條件下,蘭色深度與蛋白的量成正比.
Folin—酚試劑法最早由Lowry確定了蛋白質濃度測定的基本步驟.以后在生物化學領域得到廣泛的應用.這個測定法的優點是靈敏度高,比雙縮脲法靈敏得多,缺點是費時間較長,要精確控制操作時間,標準曲線也不是嚴格的直線形式,且專一性較差,干擾物質較多.對雙縮脲反應發生干擾的離子,同樣容易干擾Lowry反應.而且對后者的影響還要大得多.酚類、檸檬酸、硫酸銨、Tris緩沖液、甘氨酸、糖類、甘油等均有干擾作用.濃度較低的尿素(0.5%),硫酸納(1%),硝酸納(1%),三氯乙酸(0.5%),乙醇(5%),乙醚(5%),丙酮(0.5%)等溶液對顯色無影響,但這些物質濃度高時,必須作校正曲線.含硫酸銨的溶液,只須加濃碳酸鈉—氫氧化鈉溶液,即可顯色測定.若樣品酸度較高,顯色后會色淺,則必須提高碳酸鈉—氫氧化鈉溶液的濃度1~2倍.
進行測定時,加F olin—酚試劑時要特別小心,因為該試劑僅在酸性pH條件下穩定,但上述還原反應只在pH=10的情況下發生,故當Folin一酚試劑加到堿性的銅—蛋白質溶液中時,必須立即混勻,以便在磷鉬酸—磷鎢酸試劑 被破壞之前,還原反應即能發生.
此法也適用于酪氨酸和色氨酸的定量測定.
此法可檢測的最低蛋白質量達5mg.通常測定范圍是20~250mg.
(二)試劑與器材
1.試劑
(1)試劑甲：
(A) 10克 Na2CO3,2克 NaOH和0.25克酒石酸鉀鈉 (KNaC4H4O6·4H2O).溶解于500毫升蒸餾水中.
(B) 0.5克硫酸銅(CuSO4·5H2O)溶解于100毫升蒸餾水中,每次使用前,將50份(A)與1份(B)混合,即為試劑甲.
(2)試劑乙：
在2升磨口回流瓶中,加入100克鎢酸鈉(Na2WO4·2H2O),25克鉬酸鈉(Na2MoO4·2H2O)及700毫升蒸餾水,再加50毫升 85%磷酸,100毫升濃鹽酸,充分混合,接上回流管,以小火回流10小時,回流結束時,加入150克 硫 酸鋰(Li2SO4),50毫升蒸餾水及數滴液體溴,開口繼續沸騰15分鐘,以便驅除過量的溴.冷卻后溶液呈黃色(如仍呈綠色,須再重復滴加液體溴的步驟).稀釋至1升,過濾,濾液置于棕色試劑瓶中保存.使用時用標準NaOH滴定,酚酞作指示劑,然后適當稀釋,約加水1倍,使最終的酸濃度為1N左右.
(3)標準蛋白質溶液:
精確稱取結晶牛血清清蛋白或 g—球蛋白,溶于蒸餾水,濃度為250 mg/ml左右.牛血清清蛋白溶于水若混濁,可改用0.9 % NaCl溶液.
2. 器材
(1)可見光分光光度計
(2)旋渦混合器
(3)秒表
(4)試管16支
(三)操作方法
1. 標準曲線的測定：取16支大試管,1支作空白,3支留作未知樣品,其余試管分成兩組,分別加入0,0.1,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0毫升標準蛋白質溶液(濃度為250mg/ml).用水補足到1.0毫升,然后每支試管加入5毫升試劑甲,在旋渦混合器上迅速混合,于室溫(20～25℃)放置 10分鐘.再逐管加入0.5毫升試劑乙(Folin—酚試劑),同樣立即混勻.這一步混合速度要快,否則會使顯色程度減弱.然后在室溫下放置30分鐘,以未加蛋白質溶液的第一支試管作為空白對照,于700nm處測定各管中溶液的吸光度值.以蛋白質的量為橫座標,吸光度值為縱座標,繪制出標準曲線.
注意：因Lowry反應的顯色隨時間不斷加深,因此各項操作必須精確控制時間,即第1支試管加入5毫升試劑甲后,開始計時,1分鐘后,第2支試管加入5毫升試劑甲,2分鐘后加第3支試管,余此類推.全部試管加完試劑甲后若已超過10分鐘,則第1支試管可立即加入0.5毫升試劑乙,1分鐘后第2支試管加入0.5毫升試劑乙,2分鐘后加第3支試管,余此類推.待最后一支試管加完試劑后,再放置30分鐘,然后開始測定光吸收.每分鐘測一個樣品.
進行多試管操作時,為了防止出錯,每位學生都必須在實驗記錄本上預先畫好下面的表格.表中是每個試管要加入的量(毫升),并按由左至右,由上至下的順序,逐管加入.最下面兩排是計算出的每管中蛋白質的量(微克)和測得的吸光度值.
Folin—酚試劑法實驗表格：
管號 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
標準蛋白質 0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0(250mg/ml)
未知蛋白質 0.2 0.4 0.6(約250mg/ml)
蒸餾水 1.0 0.9 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0.8 0.6 0.4
試劑甲 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0
試劑乙 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
每管中蛋白質的量(ug)
吸光度值(A700)
2. 樣品的測定：取1毫升樣品溶液(其中約含蛋白質20~250微克),按上述方法進行操作,取1毫升蒸餾 水代替樣品作為空白對照.通常樣品的測定也可與標準曲線的測定放在一起,同時進行.即在標準曲線測定的各試管后面,再增加3個試管.如上表中的8、9、10試管.
根據所測樣品的吸光度值,在標準曲線上查出相應的蛋白質量,從而計算出樣品溶液的蛋白質濃度.
注意,由于各種蛋白質含有不同量的酪氨酸和苯丙氨酸,顯色的深淺往往隨不同的蛋白質而變化.因而本測定法通常只適用于測定蛋白質的相對濃度(相對于標準蛋白質).
(一)實驗原理
這種蛋白質測定法是最靈敏的方法之一.過去此法是應用最廣泛的一種方法,由于其試劑乙的配制較為困難(現在已可以訂購),近年來逐漸被考馬斯亮蘭法所取代.此法的顯色原理與雙縮脲方法是相同的,只是加入了第二種試劑,即Folin—酚試劑,以增加顯色量,從而提高了檢測蛋白質的靈敏度.這兩種顯色反應產生深蘭色的原因是:在堿性條件下,蛋白質中的肽鍵與銅結合生成復合物.Folin—酚試劑中的磷鉬酸鹽—磷鎢酸鹽被蛋白質中的酪氨酸和苯丙氨酸殘基還原,產生深蘭色(鉬蘭和鎢蘭的混合物).在一定的條件下,蘭色深度與蛋白的量成正比.
Folin—酚試劑法最早由Lowry確定了蛋白質濃度測定的基本步驟.以后在生物化學領域得到廣泛的應用.這個測定法的優點是靈敏度高,比雙縮脲法靈敏得多,缺點是費時間較長,要精確控制操作時間,標準曲線也不是嚴格的直線形式,且專一性較差,干擾物質較多.對雙縮脲反應發生干擾的離子,同樣容易干擾Lowry反應.而且對后者的影響還要大得多.酚類、檸檬酸、硫酸銨、Tris緩沖液、甘氨酸、糖類、甘油等均有干擾作用.濃度較低的尿素(0.5%),硫酸納(1%),硝酸納(1%),三氯乙酸(0.5%),乙醇(5%),乙醚(5%),丙酮(0.5%)等溶液對顯色無影響,但這些物質濃度高時,必須作校正曲線.含硫酸銨的溶液,只須加濃碳酸鈉—氫氧化鈉溶液,即可顯色測定.若樣品酸度較高,顯色后會色淺,則必須提高碳酸鈉—氫氧化鈉溶液的濃度1~2倍.
進行測定時,加F olin—酚試劑時要特別小心,因為該試劑僅在酸性pH條件下穩定,但上述還原反應只在pH=10的情況下發生,故當Folin一酚試劑加到堿性的銅—蛋白質溶液中時,必須立即混勻,以便在磷鉬酸—磷鎢酸試劑 被破壞之前,還原反應即能發生.
此法也適用于酪氨酸和色氨酸的定量測定.
此法可檢測的最低蛋白質量達5mg.通常測定范圍是20~250mg.
(二)試劑與器材
1.試劑
(1)試劑甲：
(A) 10克 Na2CO3,2克 NaOH和0.25克酒石酸鉀鈉 (KNaC4H4O6·4H2O).溶解于500毫升蒸餾水中.
(B) 0.5克硫酸銅(CuSO4·5H2O)溶解于100毫升蒸餾水中,每次使用前,將50份(A)與1份(B)混合,即為試劑甲.
(2)試劑乙：
在2升磨口回流瓶中,加入100克鎢酸鈉(Na2WO4·2H2O),25克鉬酸鈉(Na2MoO4·2H2O)及700毫升蒸餾水,再加50毫升 85%磷酸,100毫升濃鹽酸,充分混合,接上回流管,以小火回流10小時,回流結束時,加入150克 硫 酸鋰(Li2SO4),50毫升蒸餾水及數滴液體溴,開口繼續沸騰15分鐘,以便驅除過量的溴.冷卻后溶液呈黃色(如仍呈綠色,須再重復滴加液體溴的步驟).稀釋至1升,過濾,濾液置于棕色試劑瓶中保存.使用時用標準NaOH滴定,酚酞作指示劑,然后適當稀釋,約加水1倍,使最終的酸濃度為1N左右.
(3)標準蛋白質溶液:
精確稱取結晶牛血清清蛋白或 g—球蛋白,溶于蒸餾水,濃度為250 mg/ml左右.牛血清清蛋白溶于水若混濁,可改用0.9 % NaCl溶液.
2. 器材
(1)可見光分光光度計
(2)旋渦混合器
(3)秒表
(4)試管16支
(三)操作方法
1. 標準曲線的測定：取16支大試管,1支作空白,3支留作未知樣品,其余試管分成兩組,分別加入0,0.1,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0毫升標準蛋白質溶液(濃度為250mg/ml).用水補足到1.0毫升,然后每支試管加入5毫升試劑甲,在旋渦混合器上迅速混合,于室溫(20～25℃)放置 10分鐘.再逐管加入0.5毫升試劑乙(Folin—酚試劑),同樣立即混勻.這一步混合速度要快,否則會使顯色程度減弱.然后在室溫下放置30分鐘,以未加蛋白質溶液的第一支試管作為空白對照,于700nm處測定各管中溶液的吸光度值.以蛋白質的量為橫座標,吸光度值為縱座標,繪制出標準曲線.
注意：因Lowry反應的顯色隨時間不斷加深,因此各項操作必須精確控制時間,即第1支試管加入5毫升試劑甲后,開始計時,1分鐘后,第2支試管加入5毫升試劑甲,2分鐘后加第3支試管,余此類推.全部試管加完試劑甲后若已超過10分鐘,則第1支試管可立即加入0.5毫升試劑乙,1分鐘后第2支試管加入0.5毫升試劑乙,2分鐘后加第3支試管,余此類推.待最后一支試管加完試劑后,再放置30分鐘,然后開始測定光吸收.每分鐘測一個樣品.
進行多試管操作時,為了防止出錯,每位學生都必須在實驗記錄本上預先畫好下面的表格.表中是每個試管要加入的量(毫升),并按由左至右,由上至下的順序,逐管加入.最下面兩排是計算出的每管中蛋白質的量(微克)和測得的吸光度值.
Folin—酚試劑法實驗表格：
管號 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
標準蛋白質 0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0(250mg/ml)
未知蛋白質 0.2 0.4 0.6(約250mg/ml)
蒸餾水 1.0 0.9 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0.8 0.6 0.4
試劑甲 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0
試劑乙 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
每管中蛋白質的量(ug)
吸光度值(A700)
2. 樣品的測定：取1毫升樣品溶液(其中約含蛋白質20~250微克),按上述方法進行操作,取1毫升蒸餾 水代替樣品作為空白對照.通常樣品的測定也可與標準曲線的測定放在一起,同時進行.即在標準曲線測定的各試管后面,再增加3個試管.如上表中的8、9、10試管.
根據所測樣品的吸光度值,在標準曲線上查出相應的蛋白質量,從而計算出樣品溶液的蛋白質濃度.
注意,由于各種蛋白質含有不同量的酪氨酸和苯丙氨酸,顯色的深淺往往隨不同的蛋白質而變化.因而本測定法通常只適用于測定蛋白質的相對濃度(相對于標準蛋白質).
